在DNA甲基化研究中，基于PCR的方法應(yīng)用。然而，隨著新方法的不斷涌現(xiàn)，大家不免有些眼花繚亂。如何選擇的方法，這對(duì)新手而言可是個(gè)難題。近日，哥倫比亞的研究人員在《BioTechniques》雜志上發(fā)表文章，介紹了zui常用的DNA甲基化分析方法，并具體分析了每種方法的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。
DNA甲基化是研究zui為深入的表觀遺傳基因調(diào)控。研究表明，它在多個(gè)生理過程以及常見病中發(fā)揮重要作用。目前，研究DNA甲基化的平臺(tái)有很多種，這為希望踏入此領(lǐng)域的研究人員帶來了困擾。于是，文章作者介紹了一些常用的方法，包括亞硫酸氫鹽測序PCR（BSP）、甲基化特異性PCR（MSP）、MethyLight和甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析（MS-HRM）。作者認(rèn)為，這些技術(shù)不需要昂貴的儀器，適合在普通的分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室開展。
作者首先介紹了亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，這幾乎是所有DNA甲基化分析的*步。經(jīng)典方法比較耗時(shí)，通常需要16小時(shí)才能完成，而且需要多次換管，增加了污染的風(fēng)險(xiǎn)。市售的試劑盒通過縮短孵育時(shí)間和改變純化步驟來改善轉(zhuǎn)化后DNA的回收。因此，對(duì)于新手而言，強(qiáng)烈建議使用試劑盒。在選擇試劑盒時(shí)，可考慮多個(gè)因素，包括成本、產(chǎn)量、效率和時(shí)間。文章也列出了多款試劑盒的比較。
作者認(rèn)為，在DNA甲基化研究之前，還應(yīng)該評(píng)估一下轉(zhuǎn)化后DNA的質(zhì)量，這一步對(duì)定量方法特別重要，如MethyLight和MS-HRM。亞硫酸氫鹽處理可導(dǎo)致DNA片段化，因而會(huì)減少PCR擴(kuò)增后的分子數(shù)。還是用各種引物組檢驗(yàn)一下，確定的擴(kuò)增子長度。
之后作者詳細(xì)介紹了各種方法的原理、操作、優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)，包括各種BSP方法、MSP、MS-HRM及MethyLight。以經(jīng)典MSP為例，這種方法經(jīng)濟(jì)實(shí)用，靈敏度高，但不是定量的。分析只給出三種結(jié)果：甲基化等位基因的存在；未甲基化等位基因的存在；這兩種等位基因的存在。此外，低質(zhì)量的DNA也與重復(fù)性降低有關(guān)。不*的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果。
他們認(rèn)為，全基因組分析平臺(tái)有許多優(yōu)勢，但PCR方法實(shí)現(xiàn)了基因組中特定位點(diǎn)的詳細(xì)分析，如CpG島。此外，焦測序也是一種定量方法，不需要克隆，但存在PCR偏向，而且儀器也比較少。
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